目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種,無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環用時的多少。

(1) 去保護：加入Deblocking脫去堿基上5'- OH的保護基團DMT，獲得游離的5'- OH；

(2) 耦合：同時加入活化劑和新的堿基，新的堿基5'-OH仍然被DMT保護，3'端被活化與溶液中游離的5'-OH發生耦合反應；

(3) 封閉：耦合反應中極少數5'- OH沒有參加反應，用封閉試劑終止其后繼續發生反應；

(4) 氧化：加入氧化劑使其由核苷亞磷酸酯形成更穩定的核苷磷酸酯。

如何計算引物的Tm值

四種堿基的性質和各自保護基的性質都有差別。所以合成難度是不一樣的。難度最大的當屬GC重復多的和序列中還有多個連續的G的引物。尤其對于后者，一般公司都做不了20個G以上的引物。實驗證明，如果引物中有超過三個連續G的結構，傳統方法得到的產物質量就會開始下降。而且目前通用的脫鹽、OPC和PAGE方法都無效。

引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成無色或白色絮狀干粉。

干 粉：運輸時常溫運輸，-20℃可以保存一年。

儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復凍融，-20℃可以保存半年。

工作液：常規使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應避免反復凍融。

修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。